空間轉錄組測序


基因表達具有時間和空間的特異性。通過對不同時間點和部位的樣本取材,使用單細胞轉錄組測序技術能夠解析時間維度上細胞類型和基因表達的變化過程。然而單細胞測序實驗的前提是組織必須通過機械分離或酶解消化成單細胞懸液,此過程不可避免地丟失了組織中細胞所處的原始位置信息,也導致了細胞間的通訊網絡被打破,這使我們難以獲得組織中不同區域的細胞構成和基因表達狀態,以及不同功能區之間的基因差異表達等信息,F有的原位表達圖譜主要是通過報告基因或原位雜交等技術來實現,但是這些方法實現比較困難,并且通量低,限制了多樣本、高時效的應用。而空間轉錄組技術則可以高效地檢測組織中空間原始位置上的基因表達模式。

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圖1.空間轉錄組測序技術蓬勃發展


空間轉錄組(Spatial Transcriptomics)就是將基因的表達情況與關注的組織切片的免疫化學染色圖像進行整合,從而將組織內不同細胞的基因表達信息定位到組織的原始空間位置上去,進而直接觀測組織中不同部位功能區基因表達的差異?臻g轉錄組利用了常規的原位技術和組學技術兩方面的優勢,結合了芯片與高通量測序的核心概念。



   1.技術優勢


① 平臺穩定:不需要單細胞解離,組織切片即可;

② 周期短:從樣本處理到建庫僅需一天;

③ 可視化:Space Ranger可視化數據分析;

④ 空間定位:結合scRNA-seq可實現基因空間定位;

⑤ 兼容性強:人、小鼠、大鼠組織;新鮮冷凍樣品和石蠟樣本均可;

⑥ 應用領域廣:腫瘤異質性、免疫浸潤、空間發育圖譜構建、神經疾病特征、病理基因表達區域鑒定等;


 2.技術原理


將冷凍組織切片放置在10X Genomics Visium芯片的捕獲區域內,進行HE染色和成像后,對組織切片進行透化處理,細胞內的mRNA因而釋放,從而被芯片上帶有oligo-dT的探針捕獲。并且,每個探針都帶有特異的位置信息Spatial Barcode),然后以mRNA為模版進行cDNA合成,構建文庫后再測序。測序獲得基因表達信息的同時,每一條測序reads因帶有Spatial Barcode,進行對比即可獲得基因表達的位置信息。


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圖2.空間轉錄組整體實驗流程


10X Genomics Visium技術包含兩種芯片,分別為組織優化芯片Tissue Optimization和基因表達芯片Library Preparation。組織優化芯片用來摸索組織透化的最佳時間,基因表達芯片用來進行正式樣本的空間轉錄組實驗。其中基因表達芯片上有4個捕獲區域,每個區域大小為6.5 mm×6.5 mm,每個捕獲區域中5,000個帶有特異空間序列的探針簇。稱為Barcoded Spots。每個spot直徑55 μm,包含數萬個用于捕獲的oligo探針序列,相鄰兩個spots的中心距離100 μm。探針序列的結構依次測序引物結合序列,16 nt的位置序列,12 nt的UMI序列,以及30 nt的oligo-dT序列。


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圖3.空間轉錄組芯片構成

 

3.聯合單細胞測序解析細胞類型的空間位置信息


空間轉錄組測序可以獲得不同基因在組織切片上的空間位置信息,但不能獲得詳細的細胞類群信息(因為空間轉錄組不是單細胞分辨率,它以spot為單位進行分辨,只能粗略分析切片上不同位置的細胞類型。因此,需要借助單細胞測序數據來分析細胞類型,然后通過生物信息學的分析方法將單細胞類群映射到空間轉錄組數據上。

選擇已有的對應物種、組織的細胞類型注釋數據作為參考庫;趩渭毎麥y序得到的不同類群的Marker Gene,選擇參考數據庫中不同細胞類型間高度變化的基因,然后計算預測的spot與參考數據庫的相關性,通過不斷剔除相關性最差的類型以循環計算相關性,最終得到預測spot的細胞類型注釋。



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圖4.MIA(Multimodal intersection analysis)

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